蓝/白筛
蓝/白筛是一种载体遗传筛选技术，它可以快速且方便的检测重组细菌中以载体DNA为基础的分子复制实验。将合适的脱氧核糖核酸片段连接成一个载体DNA。该载体再被植入到宿主细胞（细菌），如果载体重组DNA可行，将其在有X-gal的存在下生长。此时的细菌，他的质体若有插入此载体DNA，则会产生白色菌落；反之，若细胞转型没有插入此载体DNA，则菌落即呈蓝色。
背景 编辑
分子生物学中，分子克隆是最常用的方法之一。适合序列的基因可以插入质体中并与载体连接，接著该质体转移到大肠杆菌之细胞中。然而，并非所有转化到细胞中含有目的基因的质体都有成功转移入菌落，且要检查单一菌落是否有转入目标质体基因的存在是相当耗时的，因此对于该基因转移的检测的方法，是用不同于一般而更省时有用和劳动力密集的方法。蓝/白筛即是早期开对基因转移的检测方法，借由通过不同的颜色反应来鉴定，分辨出复制成功的细菌菌落。
该方法是基于β-半乳糖苷酶的基因中α-互补的的原理。α-互补这种现象的最早是在通过实验室弗朗索瓦·雅各布和雅克莫诺的艾格尼丝乌尔曼（Ullmann）中完成制作出来的，其中，无活性突变体的β-半乳糖苷酶取代了β-半乳糖苷酶判断中相同序列的DNA而使原序列被删除，α-供体的肽，则仍然完好无损。[1] 兰利等人表明，因为其残基11-41遭到删除，该突变且无活性的β-半乳糖苷酶基因片段在其N-末端的一部分缺乏，，但还是可以由残留下的β-半乳糖苷酶3-90残基形成的肽来补充。 [2]M13丝状噬菌体后来被植入编码序列的前145氨基酸，在含有X-gal的平板上生长，并通过α-互补的机制来表示出被感染而含有无活性蛋白基因细胞的噬菌体会产生蓝色斑点。[3]
pUC系列的质体克隆载体是从M13系统开发出的采取该筛选方法构造的第一个质粒。[4]在此方法中，DNA连接到质体并破坏α肽，因此借由互补的过程，没有活性跟功能的β-半乳糖苷酶就会形成。因此，含有插入质体的细胞呈白色菌落，而细胞转化质体没有插入呈蓝色菌落; 因此一个成功转植的结果可以很容易地由从蓝色细胞与白色细胞来观察成功与否。
分子机制 编辑
β-半乳糖苷酶此蛋白质是编码在乳糖操纵子中lacZ的基因，它在其活性状态是以同源四聚体的形式存在。然而，拥有M15菌株的大肠杆菌突变体的β-半乳糖苷酶具有被删除的N-末端残基11-41，该突变体中，ω-肽无法形成的四聚体，即失去活性。该突变体蛋白的形式，因N-末端片段有α-肽的存在，其蛋白质可完全恢复其具活性的四聚体状态。突变体的β-半乳糖苷酶的功能由α-肽保全被称为α-互补。
在蓝/白筛选的方法中，宿主大肠杆菌菌株携带包含ω-肽的LacZ基因缺失突变体（lacZΔM15 )，而所用的质体携带lacZα序列中第59残基的β-半乳糖苷酶α-肽。无论本身的功能性，然而，当这两个肽一起表达，因为当该细胞含有质体被变换成lacZΔM15的lacZα的序列，所以它们得以形成一个具有功能性的β-半乳糖苷酶。
蓝/白筛选方法的作用原理是通过破坏该α-互补的过程。lacZα序列内部的质粒携带多复制端点（MCS）。这些lacZα中的MCS序列可以透过限制性内切酶进行切割，使lacZ α基因可以插入外源DNA，进而破坏该基因与制造α-肽。于是，在含有和插入的质体的细胞，会形成没有任何功能与活性的β-半乳糖苷酶。
可以通过X-gal方式检测到是否有有活性的β-半乳糖苷酶存在，具活性β-半乳糖苷酶可切割无色的模拟乳糖，之后形成5 -溴-4 -氯-吲哚酚，然后自发地二聚化以及氧化形成一个不溶于5,5' -二溴-4,4' -二氯靛的明亮的蓝色颜料。这造成带有β-半乳糖苷酶的细胞产生特别的蓝色。蓝色菌落表示它们可能含有一个不间断的lacZα载体（因此，没有插入外来DNA）；而白色菌落，其中的X-gal不会被水解，则外源转植物于lacZα中存在，扰乱了具有活性的β-半乳糖苷酶形成。
使用注意事项 编辑
蓝/白筛检测中，正确且合适的载体和感受态细胞是重要的考虑，其质粒必须包含的lacZ α，例如：pUC19和pBluescript中。该大肠杆菌细胞应含有突变的lacZ基因与已被删除的序列（即lacZΔM15）除此之外，JM109、DH5α和XL1-蓝亦为常用的细胞基因型。
还必须了解的是，乳糖操纵子是受葡萄糖的存在影响。蛋白质EIIA 葡萄糖会参与糖输入和当葡萄糖被输送到细胞中关闭乳糖通透性酶。所以在培养基板上媒介不应包括葡萄糖。
X-gal的对光是相当敏感敏感的，因此它的溶液和含有X-gal的培养基应放置于黑暗中。异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），其功能是作为对的诱导乳糖启动操纵子，可以使用在提高LacZ之生产媒介。
缺点 编辑
由于很多原因，一些白色菌落可能不包含所需的重组DNA。可能连接上不正确的DNA，并有可能对某些线性的载体DNA进行改造，将其两端“修补”并连接在一起，使得既没有LacZα产生也没有蓝色的菌落形成。基因选植区域无载体也可能出现白色，而在抗生素使用殆尽之后可能会出现卫星菌落。亦有可能是即使是蓝色菌落也含有插入片段。这发生在插入的是“帧”与LacZα基因和终止密码子，所以产生无异议之不存在的转植。这可能会导致一些融合蛋白表现，但其LacZα的表达仍然是具功能以及活性的。有时正确的重组可能构建出复杂化其身份的淡蓝色菌落。
参考文献 编辑
- ^ A. Ullmann, F. Jacob, J. Monod. Characterization by in vitro complementation of a peptide corresponding to an operator-proximal segment of the beta-galactosidase structural gene of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 1967-03-14, 24 (2): 339–343 [2019-05-25]. ISSN 0022-2836. PMID 5339877. （原始内容存档于2016-06-05）.
- ^ K. E. Langley, M. R. Villarejo, A. V. Fowler, P. J. Zamenhof, I. Zabin. Molecular basis of beta-galactosidase alpha-complementation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1975-04, 72 (4): 1254–1257 [2019-05-25]. ISSN 0027-8424. PMC 432510
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