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西方墨點法使用抗体识别修改的硫辛酸蛋白.

西方墨點法英语:Western blot)或稱「蛋白質轉漬法」、「免疫墨點法」(immunoblot)或「西式吸印雜交」,是分子生物学生物化学免疫遗传学中常用的一种实验方法,也是HIV檢測的方法之一。

利用特定抗體能夠專一結合其抗原蛋白質的原理來對樣品進行着色,通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息,來分析檢測特定蛋白質的生物學檢測技術。

发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)。[1]在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为“Western印迹法”。

目录

原理编辑

Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE(根據分子大小)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

實驗步驟编辑

實驗大致分為鑄膠、跑膠、轉漬、接一級抗體、接二級抗體以及壓片幾個部分。

组织准备编辑

样本可以从整个组织或者细胞培养物中获得。固体组织首先需要被机械性的破碎,可以使用搅拌器(对于较大体积的样本),匀质机(对于小体积的样本),或者利用超声波粉碎。细胞也可以通过上述方式机械性的被破开。当然病毒及环境样本也可以是蛋白的来源,因此Wester Blotting并不仅限于细胞研究。

合适的清洁剂、盐类和Buffer都可以被用于裂解细胞以及溶解蛋白。蛋白酶和磷酸酶抑制剂经常被添加,以防护样品被其自身的酶消化掉。组织准备经常在冷低温条件下进行,以避免蛋白变性和降解。

生物化学与机械技术(包括各种形式的过滤和离心)的结合,可用于分离不同的细胞室与细胞器。

凝膠電泳编辑

样本中的蛋白质通过凝胶电泳进行分离。蛋白质可以通过等电点(pl),分子量,电荷,以及上述因素的组合进行分离。分离的实际效果取决于样本的处理和凝胶的性质。这是用来识别某种蛋白的一个非常有用的方法。

到目前为止,最常见的凝胶电泳方式是采用聚丙烯酰胺凝胶十二烷基硫酸钠(SDS)作为缓冲负载的组合。SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)能够保存处在变性状态下的多肽,这些多肽由蛋白质被强还原剂还原而失去了二三级结构产生(例:从二硫键[S-S]到巯基[SH and SH]),通过他们不同的分子量,从而将蛋白质分离。采样蛋白被带负电荷的SDS包裹,并通过凝胶的丙烯酰胺网格移动到带正电的电荷上。较小的蛋白质会更快的迁移通过这个网格,因此蛋白质是通过大小(通常用千道尔顿,kDa作为量度单位)进行分离的。丙烯酰胺浓度决定了凝胶的分辨率:丙烯酰胺浓度越大,较低分子量的蛋白质的分辨率越好。丙烯酰胺浓度越低,高分子量的蛋白质的分辨率越好。蛋白质通常在凝胶上只沿一维做线性运动形成印痕。

样品被加载到凝胶的泉点。第一道通常是预留给标记物或者梯度物的,它们是一些市售的蛋白质混合物,具有标定的分子量,能形成典型可见的彩色染色条带。当电压被施加在凝胶上,蛋白质透过其以不同的速度进行迁移,取决于蛋白质的大小。这些不同的前进速率(不同的电泳迁移率)在每个道内单独形成条带。

它也可以使用两维(2-D)的凝胶,蛋白质从一个单一样品中沿两个维度传播。蛋白质按等电点(蛋白质解离成阴阳离子的趋势或程度相同,使得净电荷成中性,此时的pH值即为等电点)在第一个维度分离,并根据其分子量在第二个维度中分离。

轉漬编辑

要讓抗體成功對蛋白質產生反應,就要將蛋白質从凝胶中转移到用硝化纤维聚偏二氟乙烯(PVDF)製成的膜。轉漬蛋白質時,最常用的方法稱爲"电印迹"(Electroblotting),即運用電流,從凝膠中牽引出帶負電荷的蛋白質,使其向帶正電荷的陽極方向移動,進入PVDF或硝化纖維膜內。蛋白質自凝膠移入膜內時,可維持其在凝膠內形成的結構。較舊的轉漬方法,則是在凝膠上先放一塊膜,再放一疊濾紙,然後,將其整疊移至緩衝溶液中,溶液在毛細管作用下會帶動蛋白質,一同由下而上進入濾紙。但實際上由於耗時長,該方法並不常用。 不論採用何種方法,轉漬完成後,蛋白質便會顯露於薄膜上,可供檢測。

封闭编辑

由于膜能结合蛋白质,所以抗体以及目标蛋白都可以结合到膜上,也因此我们必须防止膜和抗体的反应发生。把膜放在稀释的蛋白质溶液中(比如3-5%的牛血清蛋白、脱脂牛奶、TBS或者I-Block)可以阻挡非特定的结合。稀释溶液中的蛋白会把膜上没有与目标蛋白结合的地方全部结合,因此加了抗体之后,膜上就没有空间去结合其他非目标蛋白。阻拦是实验最后的铺垫,可以使结果更清晰,排除错误可能性。

检测编辑

在检测过程中,膜被“探测”为了目标蛋白质与修饰的抗体被连接到一种报告酶; 当暴露于适当的底物时,这种酶驱动比色反应并产生颜色。由于各种原因,这传统上发生在一个两步法的过程中,虽然现在某些应用中可以用一步法的检测方法。

两步法编辑

一步法编辑

 
西方墨点法使用放射性检测系统.

分析编辑

在未结合的探测剂被洗去之后,西方墨点法准备好检测被标记和结合到目标蛋白质的探测剂。在实际应用中,并不是所有的西方墨点法揭示蛋白质仅在一种膜上的一个条带。

分类编辑

Western Blot显色的方法主要有以下几种:

  • 放射自显影
  • 底物化学发光ECL
  • 底物荧光ECF
  • 底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。

医学诊断应用编辑

  • 确证HIV檢測采用西方墨點法以检测在人血清样品中的抗-HIV抗体。
  • 西方墨點法还用作决定性测试牛海绵状脑病(BSE,通常被称为“疯牛病”)。
  • 某些形式的莱姆病检测用西方墨點法。
  • 西方墨點法也可以被用来作为乙型肝炎病毒感染的确定测试。
  • 在兽医中,西方墨點法有时被用于确认猫的貓免疫缺陷病毒FIV+状态。

參見编辑

参考文献编辑

  1. ^ Alwine J, Kemp D, Stark G,. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes.. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1977, 74 (12): 5350–5354. PMC 431715. PMID 414220. doi:10.1073/pnas.74.12.5350. 

外部链接编辑